Western Blot常見問題及處理（1）
1、western blot 的優(yōu)點(diǎn)
答： 靈敏，可達(dá)ng級(jí)，用Ecl顯色法理論上可達(dá)pg 級(jí)。方便，特異性高。
2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白？
答： 原因有很多：
a) 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；
b) 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；
c) 你的抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說明，看是否有問題。
3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答： a) 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻]有變性完全，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng)， b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可。
4、我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0KD），請(qǐng)問怎么做WB？
答：可以選擇0.2μml的膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。
5、我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？
答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。
6、膠片背景很臟，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時(shí)間，提高牛奶濃度。
7、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？
答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。
8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；
b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；
c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；
d) 二抗失活。
9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b) 顯影時(shí)間過長(zhǎng)。
10、DAB好還是ECM好？
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè)pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。
11、抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大，是怎么回事？
答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)，可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。
12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么？
答：可能是：a)樣品濃度過低；b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠。
13、磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？
答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。
14、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？
答： ① 免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是不能定位。
② 兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會(huì)說明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
15、做Western Blot時(shí)，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？
答：懷疑是樣品問題，可能是：
1，樣品不能反復(fù)凍融；
2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
16、細(xì)胞水平要做western blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot？
答：一般5×10^6就足夠了。
17、同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么？這樣對(duì)western blot有無影響？
答：能，沒有問題。
18、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎？
答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。
19、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時(shí)最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？
答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，加20％甲醇。
21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？
答：200kd的蛋白不好做， 分離膠用7％，積層膠 3.5％。
22、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？
答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
23、蛋白變性后可以存放多久？
答：－80℃，一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。
24、我所測(cè)定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?05KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。
25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成，是嗎？
答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼?，用ＢＳＡ代替?yīng)該好一點(diǎn)．
西安中開生物科技有限公司版權(quán)所有備案號(hào)：陜ICP備18001587號(hào)-1
