如果你打算將目的蛋白應用于下游實驗，那么成功表達重組蛋白是很重要的。如果一開始，你花點時間優(yōu)化蛋白的可溶性，將會大大節(jié)約你后續(xù)純化的時間。關于重組蛋白表達和純化，可參考如下建議：
選擇“正確”標簽可能是一項艱巨的任務。理想的標簽將幫助你獲得可溶性蛋白，簡化你的純化方案，并且不會干擾下游應用。然而，考慮到載體可用的切割位點過多，你唯一的擔心應該是哪個標簽將有助于目標蛋白的溶解、表達和純化—標簽總是可以切除的，如果你擔心它會干擾目標蛋白的行為。
某些標簽，例如谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）或麥芽糖結合蛋白（MBP）被認為可增加蛋白的溶解性。這些標簽的缺點是它們的大小—GST約26kDa，MBP為41kDa。 其他標簽（六聚組氨酸，FLAG，鏈霉親和素）相對較小，通常選擇它們以便于捕獲和純化。 選擇幾個不同的標簽，然后克隆！如果可能的話，使用C端標簽，這意味著你純化的任何蛋白將是全長，沒有任何截斷。
獲得可溶性蛋白
重組蛋白表達的常見問題是真核蛋白在細菌中表達時傾向于不溶。變性，聚集和/或截短形式的蛋白形成不可溶的包涵體，需要進一步純化和重折疊，這可能是低效的和不完全的。
以下是獲得可溶性天然蛋白質的三個關鍵參數：
IPTG濃度
有可能，宿主中的蛋白表達將通過lac操縱子系統(tǒng)操作。這個系統(tǒng)的詳細解釋可以在別處找到，你加入異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），一種乳糖類似物，控制蛋白的表達。蛋白的表達應處于生長的對數期，即當溶液的波長600（OD 600）處的光密度達到0.4-0.6。 如果你的目標是可溶性蛋白質，最好不要改變細胞中蛋白的折疊功能。已經假定不溶性蛋白可能是由于分子伴侶的存在。因此，使用高濃度的IPTG（> 1mM）可能不總是產生最好的結果。嘗試幾個不同的濃度，看看哪一個給你最高的可溶性蛋白的產量。
溫度
偶爾，你可以在37°C的典型溫度下，通過生長和誘導分離可溶性形式的蛋白質，但通常情況下，溶解度在較低溫度下增強?？蓢L試在30°C，25°C和18°C下進行誘導。 注意：如果首先在37℃生長，先讓培養(yǎng)物冷卻到誘導溫度，再加入IPTG。
誘導時間
更長并不總是更好。對于對宿主有毒的蛋白尤其如此。在誘導期間，每隔幾個小時取樣，并檢查目的蛋白的表達。典型的誘導時間根據溫度而變化：對于37℃，嘗試4小時;對于30℃，進行5-6小時，并且任何低于25℃的溫度應該允許生長過夜。
預實驗
將目的蛋白的編碼序列克隆到具有不同標記（例如六組氨酸，谷胱甘肽-S-轉移酶（GST），麥芽糖結合蛋白（MBP））的2-3個載體中。然后選擇三種不同的誘導時間和溫度以及幾種IPTG濃度。進行小規(guī)模預實驗。誘導后，分析每個樣本中的（1）未誘導樣本；（2）在不同時間點的誘導樣本；（3）裂解物；（4）可溶性片段。
將目的蛋白的編碼序列克隆到具有不同標記（例如六組氨酸，谷胱甘肽-S-轉移酶（GST），麥芽糖結合蛋白（MBP））的2-3個載體中。然后選擇三種不同的誘導時間和溫度以及幾種IPTG濃度。進行小規(guī)模預實驗。誘導后，分析每個樣本中的（1）未誘導樣本；（2）在不同時間點的誘導樣本；（3）裂解物；（4）可溶性片段。
以上建議都沒有達到預期的效果？
雖然遵循了上面的建議，你可能會發(fā)現，你仍然無法獲得可溶性蛋白，或許可以嘗試如下解決方案：
只表達目標蛋白的一部分：較小的結構域通常是可溶的，即使全長蛋白不是；
使用不同的表達系統(tǒng)：這甚至可能保留目標蛋白的翻譯后修飾；
在變性條件下純化：雖然不總是最好的方法，在變性條件下（即在高濃度的胍或尿素的離液鹽中）純化有時是唯一的解決方案。通常這些條件可以給你一個更純的樣品，因為可溶性污染蛋白被移除。唯一的問題是重折疊；然而，有許多方案可用于包涵體蛋白的重折疊。
西安中開生物科技有限公司版權所有備案號：陜ICP備18001587號-1
